研究簡介:子癇前期是一種嚴重的妊娠并發(fā)癥，其特征之一是高血壓和蛋白尿。循環(huán)中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1（sFlt-1）水平的升高被認為是導致這些癥狀的主要原因之一。sFlt-1是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）受體的可溶性分泌形式，能夠作為VEGF和胎盤生長因子（PlGF）的拮抗劑，導致內(nèi)皮功能障礙。硫化氫是一種內(nèi)源性氣態(tài)信號分子，與多種生理和病理過程有關，包括血管擴張、血管生成和炎癥。胎盤組織能夠產(chǎn)生H2S，而H2S的產(chǎn)生與γ-半胱氨酸裂解酶（CSE）和β-半胱氨酸合成酶（CBS）等酶的活性有關。除了已知的CSE和CBS，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶（3-MST）也在人類胎盤中被發(fā)現(xiàn)，并且主要定位于合胞滋養(yǎng)細胞。研究發(fā)現(xiàn)，H2S能夠抑制胎盤中sFlt-1的釋放。本研究進一步探討了內(nèi)源性H2S對sFlt-1生成的影響，以及在胎盤中發(fā)揮作用的H2S生成酶。miR133b是一種小RNA分子，參與了H2S抑制sFlt-1生成的過程。研究發(fā)現(xiàn)，H2S處理能夠降低sFlt-1 mRNA的半衰期，并增加miR-133b的表達。本研究旨在闡明內(nèi)源性H2S如何影響sFlt-1的生成，并探討了miR133b在這一過程中的作用，以及H2S生成酶在胎盤中的表達和功能。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應用

將約100毫克的胎盤組織或培養(yǎng)細胞樣本放入含有蛋白酶抑制劑，2毫摩爾苯甲基磺酰氟、1毫摩爾正釩酸鈉和10毫克/毫升阿普羅寧)的PBS中，置于冰浴上。組織勻漿后在4℃溫度下離心，然后收集上清液。使用微型H2S微呼吸電極(H2S-MRCh型，Unisense，丹麥)和Unisense PA2000放大器測定H2S生成的實時動力學(Zhu等，2013年)。簡而言之，測量是在溫控微呼吸系統(tǒng)(Unisense)中進行的。傳感器信號穩(wěn)定后，加入L-半胱氨酸(1mmol/L)和產(chǎn)生H2S的輔助因子吡哆醛-50-磷酸(PLP，1mmol/L)。然后在每個痕量的最初最陡斜坡處測定H2S生成率。

實驗結果

研究獲得的RIA、NKA豐度、rOCR和長度缺乏差異表明，白鱸幼蟲能夠應對OA，而在暴露于OA時，離子傳輸能力、能量消耗或生長不會發(fā)生重大變化。預計下個世紀的pCO 2會升高（~2000μatm）。然而，深入的分析為潛在的新效應提供了線索，例如離子細胞大小的變化，并有助于確定需要對海洋魚類幼蟲的基本生理學、它們響應OA和多重應激源的能量分配以及通過親本效應、發(fā)育可塑性和自然選擇實現(xiàn)跨代適應的潛力。這凸顯了根據(jù)急性實驗室研究來確定OA對海洋生物的潛在影響的難度。

圖1、CBS、CSE和3-MST在人類胎盤中的表達。A-F：免疫細胞化學分析顯示了健康胎盤和子癇前期胎盤中CBS(A&D)、CSE(B&E)和3MST(C&F)陽性染色的代表性切片。G-I為陰性對照切片，使用的一抗與過量10倍的相應阻斷肽(G&H)或IgG(I)預孵育。

圖2、健康胎盤和子癇前期胎盤中的3-MST含量和H2S生成率。胎盤組織取自健康孕婦(n=23)和子癇前期孕婦(n=19)。A：通過實時RT-PCR檢測3-MST的mRNA水平。B：用Western印跡法測定3-MST的蛋白水平。具有代表性的蛋白條帶顯示在相應直方圖的頂部。C，正常胎盤和子癇前期胎盤的H2S生成率。上圖為胎盤組織勻漿中H2S生成的代表性痕跡。下圖為正常胎盤和子癇前期胎盤中H2S生成率的累積數(shù)據(jù)。

圖3、H2S調(diào)節(jié)人胎盤細胞中sFlt-1的產(chǎn)生。A和B，NaHS和L-半胱氨酸對培養(yǎng)的胎盤細胞中sFlt-1生成的影響。用酶聯(lián)免疫吸附法測定培養(yǎng)基中sFlt-1蛋白水平。實時RT-PCR檢測細胞中sFlt-1的mRNA水平。C，L-半胱氨酸對敲除CBS或CSE的細胞中sFlt-1生成的影響。用對照siRNA、CBS siRNA或CSE siRNA轉(zhuǎn)染細胞，然后用L-半胱氨酸(2×10-3M)處理24小時。

圖4、H2S對sFlt-1穩(wěn)定性和miR-133b表達的影響。A&B，mRNA抑制劑DRB對NaHS(A)和L-半胱氨酸(B)處理的滋養(yǎng)細胞中sFlt-1 mRNA表達的影響。用NaHS(8×10-5M)或L-半胱氨酸(2×10-3M)預處理胎盤滋養(yǎng)細胞12小時，然后用DRB(25×10-6M)處理。之后在指定的時間點分離總RNA，并通過實時RT-PCR檢測mRNA的穩(wěn)態(tài)水平。18S-RNA用作負載對照。C&D，NaHS(C)和L-半胱氨酸(D)對胎盤滋養(yǎng)細胞中miR-133b表達的影響。用不同濃度的NaHS處理細胞24小時，然后收獲細胞測定miR133b的水平。

圖5、Flt-1是miR-133b的直接靶標。A，miR133b的模擬物對胎盤細胞中sFlt-1基礎水平的影響。細胞中sFlt-1的mRNA水平和培養(yǎng)基中sFlt-1的蛋白濃度分別通過實時RT-PCR和ELISA法測定。B，miR133b抑制劑對胎盤滋養(yǎng)層細胞中sFlt-1基礎水平的影響。C，sFlt-1 3’UTRs中預測的miR-133b靶序列及其3’UTRs中的突變核苷酸。D，含有sFlt-1 3’UTR及其突變核苷酸的熒光素酶檢測報告。在沒有或存在miR133b模擬物的情況下，用上述報告物轉(zhuǎn)染胎盤滋養(yǎng)細胞。使用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)測量細胞裂解物中的熒光素酶活性。

結論與展望

胎盤中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)的分泌增加是導致子癇前期的主要原因之一。之前的研究表明，硫化氫(H2S)能抑制胎盤中sFlt-1的釋放。在本研究中，研究人員試圖探究內(nèi)源性H2S是否會影響sFlt-1的生成，并闡明是哪種H2S生成酶在胎盤中發(fā)揮了作用。研究發(fā)現(xiàn)除了β-半胱氨酸合成酶(CBS)和γ-半胱氨酸裂解酶(CSE)外，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-MST)也在人類胎盤中被發(fā)現(xiàn)，并且主要定位于合胞滋養(yǎng)細胞。3-MST在先兆子癇胎盤和正常胎盤中的表達水平無明顯差異。用NaHS和L-半胱氨酸處理培養(yǎng)的合胞滋養(yǎng)細胞可抑制sFlt-1 mRNA的表達，并導致細胞培養(yǎng)基中的sFlt-1蛋白含量下降。用CBS siRNA和CSE siRNA轉(zhuǎn)染合胞滋養(yǎng)細胞可逆轉(zhuǎn)L-半胱氨酸的上述作用。此外NaHS和L-半胱氨酸處理降低了sFlt-1 mRNA的半衰期，增加了靶向sFlt-1的miR-133b的表達。MiR-133b在先兆子癇胎盤中表達下調(diào)，并與CBS和CSE水平相關。Unisense微呼吸系統(tǒng)被用來實時測量胎盤組織或培養(yǎng)細胞樣本中硫化氫（H2S）的產(chǎn)量，并能夠精確地測量和分析胎盤組織和細胞中H2S的產(chǎn)生情況，這對于理解H2S在胎盤功能和子癇前期發(fā)展中的作用至關重要。這些結果表明，H2S是胎盤中產(chǎn)生sFlt-1的重要調(diào)節(jié)因素。本論文的結論強調(diào)了H2S在胎盤中作為sFlt-1生成的重要調(diào)節(jié)因素，以及CSE和CBS表達量的減少可能是導致先兆子癇胎盤中sFlt-1生成量升高的原因之一。為理解子癇前期的分子機制提供了新的見解，并可能有助于開發(fā)預防和治療這一妊娠并發(fā)癥的新策略。