03.使用3DFG MEA進(jìn)行細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)記錄

我們按照先前報(bào)道的協(xié)議將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs）培養(yǎng)在3DFG MEA上。培養(yǎng)至少3天后，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs）獲得自發(fā)且規(guī)律的電活動(dòng)和機(jī)械收縮。3DFG MEA能夠檢測(cè)到2D心臟培養(yǎng)物的自發(fā)動(dòng)作電位，信噪比約為27分貝。細(xì)胞外動(dòng)作電位呈現(xiàn)出典型的負(fù)相和預(yù)期的Q相（Na+峰值）短于30毫秒。培養(yǎng)物的自發(fā)跳動(dòng)頻率約為每分鐘60次，這與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs）的預(yù)期相符。正如先前的研究中所觀察到的那樣，在生理?xiàng)l件下，即在沒(méi)有用于穿孔細(xì)胞膜的任何外部刺激的情況下，使用3DFG電極進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位記錄不會(huì)發(fā)生。這表明盡管細(xì)胞與材料之間形成了緊密的黏附，但3DFG并不會(huì)自發(fā)地被心肌細(xì)胞內(nèi)化。

圖3電生理記錄。（A）使用50微米電極的3DFG-MEA對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs）進(jìn)行的代表性體外場(chǎng)電位（FP）記錄。（B）激光照射后在50微米電極的3DFG-MEA上進(jìn)行的代表性細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位（AP）記錄。（C）激光照射后細(xì)胞膜修復(fù)以及體外場(chǎng)電位信號(hào)重新出現(xiàn)時(shí)細(xì)胞內(nèi)耦合的時(shí)間穩(wěn)定性。右側(cè)顯示，用激光第二次刺激心肌細(xì)胞，產(chǎn)生新的孔隙并恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)AP記錄。

用1064納米超快脈沖激光以約1毫瓦的功率進(jìn)行刺激，獲得了細(xì)胞內(nèi)AP，表明3DFG在激光脈沖照射下成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞膜的光穿孔。激光刺激后獲得的信號(hào)顯示單相正峰，平均持續(xù)時(shí)間為206±28毫秒（以562個(gè)AP的50%振幅計(jì)算）。所獲取的信號(hào)呈現(xiàn)出預(yù)期的心臟動(dòng)作電位成分，即初始的急劇去極化階段、輕微的復(fù)極化隨后是較長(zhǎng)的平臺(tái)期以及最終的復(fù)極化階段。細(xì)胞膜光穿孔可能歸因于在超快脈沖激光照射期間，3DFG電極發(fā)射出熱載流子。正如先前的研究中所報(bào)道的那樣，這些熱載流子處于熱力學(xué)非平衡狀態(tài)，能量很高，能夠在與3DFG的界面處形成電子等離子體。如果局部熱載流子密度超過(guò)某一閾值，電子等離子體的弛豫及其與水分子的碰撞會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生空化納米氣泡，從而局部破壞細(xì)胞膜。熱電子與水分子的碰撞使其平均自由程限制在電解質(zhì)-材料界面附近的幾十納米內(nèi)。因此，光穿孔事件極其局限于激光激發(fā)的小區(qū)域（聚焦光斑直徑約為2微米）。由于大部分光能都用于發(fā)射電子，整個(gè)過(guò)程不會(huì)影響局部溫度（不產(chǎn)生熱量）。

我們對(duì)分布在三個(gè)不同的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞心肌細(xì)胞培養(yǎng)物中的六個(gè)3DFG多電極陣列進(jìn)行了細(xì)胞穿孔電生理實(shí)驗(yàn)（包括下一節(jié)中的實(shí)驗(yàn)）。3DFG實(shí)現(xiàn)局部光穿孔的成功率高達(dá)90%，與使用其他材料獲得的先前結(jié)果一致。在3DFG多電極陣列上獲取的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位幅度從幾百微伏到5至6毫伏不等（平均細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位約為3.56±1.96毫伏），信噪比高達(dá)43分貝。在我們的實(shí)驗(yàn)中，穿孔后可獲得的最大幅度受到采集系統(tǒng)規(guī)格的限制。幅度高于6毫伏的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位有可能被記錄下來(lái)，但放大器的飽和會(huì)失真這些信號(hào)，因此被丟棄。

平均而言，5微米的3DFG超微電極比50微米的微電極能獲取到幅度更高的動(dòng)作電位。這可歸因于電極尺寸較小，導(dǎo)致光穿孔后密封電阻更高。為了突出3DFG-MEAs多通道細(xì)胞內(nèi)記錄的優(yōu)勢(shì)，我們?cè)趫DS6中報(bào)告了一個(gè)在同一MEA上多個(gè)3DFG電極同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)記錄的示例。我們通過(guò)將MEA設(shè)備置于激光束下移動(dòng)，并隨后在同一樣本上對(duì)多個(gè)電極進(jìn)行光穿孔來(lái)獲得這些測(cè)量值。由于所有光穿孔事件可在幾秒內(nèi)完成，而細(xì)胞內(nèi)信號(hào)穩(wěn)定幾分鐘，因此我們有充足的時(shí)間窗口，可同時(shí)從多個(gè)3DFG電極記錄細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位。對(duì)于心肌細(xì)胞，這些多點(diǎn)測(cè)量有助于繪制合胞體中信號(hào)傳播的模式和速度，并通過(guò)增加分析細(xì)胞的數(shù)量來(lái)提高數(shù)據(jù)的可靠性。圖S6還提供了所獲取細(xì)胞內(nèi)信號(hào)變化性的見(jiàn)解。我們可以觀察到，信號(hào)的幅度因光穿孔后細(xì)胞內(nèi)耦合程度的不同而有所差異。然而，各細(xì)胞中信號(hào)的形狀及其持續(xù)時(shí)間仍保持相對(duì)穩(wěn)定，其變化處于商業(yè)hiPSC-CM系列中典型的心臟類型變異性范圍內(nèi)。

與使用其他微電極材料時(shí)觀察到的情況一樣，在3DFG上的光穿孔過(guò)程是非侵入性的，因?yàn)榭梢栽谕患?xì)胞上重復(fù)多次。在圖3C所示的例子中，在首次光穿孔事件后幾分鐘內(nèi)記錄到的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位（AP）幅度約為1.5 mV。隨著細(xì)胞膜的修復(fù)，信號(hào)幅度降低，細(xì)胞外場(chǎng)電位（FP）的形狀再次變得明顯。此時(shí)，我們?cè)诳拷状渭ぐl(fā)的位置（距離首次激發(fā)幾微米）再次激發(fā)細(xì)胞，以使完全細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位的形狀立即恢復(fù)。第二次穿孔后的信號(hào)幅度更高，達(dá)到約3 mV。然而，首次穿孔事件和第二次穿孔事件期間動(dòng)作電位（AP）的持續(xù)時(shí)間并無(wú)差異。此外，在首次和第二次穿孔事件期間，培養(yǎng)物的跳動(dòng)頻率也保持不變。平均而言，多次光穿孔事件后記錄的動(dòng)作電位幅度更高，這是由于相對(duì)于總細(xì)胞-電極粘附面積，細(xì)胞內(nèi)耦合面積增加所致。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，通過(guò)延長(zhǎng)單次光穿孔事件后3DFG的細(xì)胞內(nèi)耦合，也可能實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)序列的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位記錄。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，未來(lái)3DFG MEA的配置中可以采用文獻(xiàn)中的各種策略。用作3DFG生長(zhǎng)模板的突出納米結(jié)構(gòu)可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞吞噬作用和誘導(dǎo)細(xì)胞膜彎曲來(lái)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)耦合，而細(xì)胞膜彎曲反過(guò)來(lái)又能激活局部?jī)?nèi)吞作用蛋白的募集。為了更好地評(píng)估3DFG結(jié)合光穿孔技術(shù)的細(xì)胞內(nèi)記錄性能，我們?cè)诒鞸1中報(bào)告了我們技術(shù)的主要特點(diǎn)以及其他在心肌細(xì)胞上測(cè)試的方法的特點(diǎn)。