生物獲取營(yíng)養(yǎng)首先需要識(shí)別并傳感到營(yíng)養(yǎng)才可能根據(jù)自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求情況吸收相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)。植物要平衡、調(diào)節(jié)其體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)，必須建立有效的傳感系統(tǒng)，用來(lái)迅速傳感各個(gè)營(yíng)養(yǎng)素在根際土壤中是否存在及其濃度的信息，以應(yīng)對(duì)土壤中可利用的養(yǎng)分在時(shí)間和空間上的劇烈波動(dòng)。氮是植物生長(zhǎng)最重要的元素，尿素CO(NH2)2是全球最常用的氮肥。尿素不僅相對(duì)含氮量高，而且是植物體內(nèi)精氨酸循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，對(duì)植物體內(nèi)的氮素循環(huán)和碳氮平衡起到重要作用。

高等植物對(duì)無(wú)機(jī)氮(銨態(tài)氮、硝態(tài)氮)和有機(jī)氮的傳感吸收能力各有不同，現(xiàn)有的研究表明，大多數(shù)植物都存在對(duì)不同種類氮源的低親和力和高親和力2種傳感轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。迄今為止，對(duì)于氮源傳感和吸收的研究主要集中在植物體內(nèi)硝酸根離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和銨根離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，但對(duì)尿素傳感、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的鑒定和相關(guān)功能的研究還停留在尿素也可以作為植物快速吸收利用的氮源階段。雖然已發(fā)現(xiàn)了2類轉(zhuǎn)運(yùn)尿素的膜蛋白，即MIPs和DUR3，它們分別在低親和力、高親和力尿素吸收和運(yùn)輸中發(fā)揮作用，但是其確切的傳感受體和機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

尿素的大量施用雖有助于農(nóng)作物提高產(chǎn)量，但是由于植物對(duì)氮的利用效率并不清楚，這種做法會(huì)因?yàn)榈獱I(yíng)養(yǎng)過(guò)剩而嚴(yán)重危害環(huán)境。尋找適合植物的最佳施肥量，需要深入了解不同植物根系傳感和吸收營(yíng)養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)規(guī)律。植物根系對(duì)養(yǎng)分的傳感能力始終受到科學(xué)家的關(guān)注，現(xiàn)有的研究方法多為通過(guò)同位素標(biāo)記檢測(cè)其相關(guān)的吸收動(dòng)力學(xué)或是異源表達(dá)相關(guān)基因驗(yàn)證其效果，但根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)的傳感能力應(yīng)遠(yuǎn)高于其吸收能力，而生物必須先傳感到營(yíng)養(yǎng)才可以進(jìn)一步吸收利用。本課題組經(jīng)過(guò)多年研究，已經(jīng)成功構(gòu)建了動(dòng)物受體傳感器和動(dòng)物組織傳感器，并進(jìn)行了相關(guān)物質(zhì)的傳感動(dòng)力學(xué)研究。目前在植物組織或植物受體傳感器的研究方面尚未見報(bào)道，如果能夠成功構(gòu)建植物根分生組織和受體傳感器，并對(duì)相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物配體進(jìn)行傳感動(dòng)力學(xué)研究，一方面有助于解決當(dāng)下過(guò)度施肥引起的土壤板結(jié)和水環(huán)境污染;另一方面有助于進(jìn)一步采用生物技術(shù)方法提高植物氮素利用效率。該傳感器的成功構(gòu)建可為植物根系營(yíng)養(yǎng)傳感及其吸收和調(diào)節(jié)機(jī)制研究、農(nóng)業(yè)精準(zhǔn)施肥提供一種新的研究方法。

本研究選擇玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜4種植物的根尖分生組織組裝傳感器，定量化測(cè)定傳感配體——尿素。通過(guò)電化學(xué)工作站和時(shí)間—電流曲線法測(cè)定尿素與玉米、辣椒、花椰菜和黃瓜根尖分生組織相互作用所產(chǎn)生的配體—受體識(shí)別和聯(lián)動(dòng)變構(gòu)所產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)，得到4種植物根尖對(duì)尿素的傳感范圍和相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并通過(guò)相應(yīng)的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其真實(shí)的生物學(xué)作用。

1材料與方法

1.1材料與試劑

玉米(Zea mays L.)、辣椒(Capsicum annuumL.苗、花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis L.)、黃瓜(Cucumissativus L.)苗各10株?？扇苄缘矸?、無(wú)水CaCl2、尿素等均購(gòu)自天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠(中國(guó))。海藻酸鈉來(lái)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所(中國(guó))。所有其他化學(xué)品均為分析純。去離子水來(lái)自Millipore公司的Milli-Q純水系統(tǒng)(Elix Essential 5，美國(guó))，并被用在所有的實(shí)驗(yàn)中。

CHI660E型電化學(xué)工作站購(gòu)自上海辰華儀器有限公司(中國(guó)上海);核微孔膜(孔徑0.22μm，周長(zhǎng)25 mm)購(gòu)自Whatman公司(英國(guó))。

1.2電極預(yù)處理與效果表征

將玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE)用不同粒徑的α-Al2O3漿(1.00、0.30、0.05μm)在麂皮上拋光，每次拋光后在超聲波水浴中清洗30 s，重復(fù)2~3次，然后用超純水清洗玻碳電極。在1 mol·L-1 H2SO4溶液中使用循環(huán)伏安法對(duì)玻碳電極進(jìn)行活化，活化時(shí)電壓的掃描范圍是-1.0~1.0 V、掃描速率是100 mV·s-1，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線圖。

將活化的玻碳電極置于1×10-3 mol·L-1 K3Fe(CN)6溶液(含0.20mol·L-1 KNO3)中對(duì)其進(jìn)行循環(huán)伏安曲線掃描，電壓的掃描范圍為-0.1~0.6 V，掃描速度為50 mV·s-1。同時(shí)，使用交流阻抗法表征電子傳遞到電極表面所受到的阻抗大小，以達(dá)到間接表征電極預(yù)處理后的界面情況。最后置于氮?dú)猸h(huán)境中干燥待用。

1.3電化學(xué)生物傳感器的制備

溶液配置:①1%的可溶性淀粉溶液:稱取1 g可溶性淀粉溶于99 mL超純水中，之后加入1 mL 10%的戊二醛，80℃水浴攪拌加熱30 min。室溫條件下放置過(guò)夜。②2%的海藻酸鈉溶液:稱取2 g海藻酸鈉溶于100 mL超純水中，攪拌過(guò)夜。③5%的CaCl2溶液:稱取5 g CaCl2溶于100 mL超純水中。④將1%的可溶性淀粉溶液與2%的海藻酸鈉溶液以體積比1:1混勻在平皿中，另取一平皿吸取等體積的5%的CaCl2溶液。

固定化植物組織傳感器組裝:將新鮮的根尖分生組織用超純水清洗干凈，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀切碎，過(guò)程中保持根尖濕潤(rùn)，立即儲(chǔ)藏在4℃冰箱中備用。

將準(zhǔn)備好的0.25 cm2的植物根尖分生組織放置于一張直徑為25 mm、孔徑為0.22μm的核微孔膜的圓心上，然后覆蓋另一張，迅速將1號(hào)培養(yǎng)皿中的混合液均勻涂抹在核微孔膜邊緣，再將其邊緣浸沒在2號(hào)培養(yǎng)皿中，使得海藻酸鈉與CaCl2完全交聯(lián)，得到穩(wěn)定的螯合物，然后用超純水沖洗組裝好的植物根尖分生組織測(cè)定膜，沖洗掉殘留在膜上的Cl-、Ca2+等離子，最后將組裝好的植物根尖分生組織測(cè)定膜用皮筋固定在玻碳電極上，植物根尖分生組織要完全覆蓋電極極芯，再用超純水沖淋電極制成生物傳感器(圖1)。

圖1植物根尖分生組織傳感器測(cè)定原理圖

1.4電化學(xué)生物傳感器對(duì)植物根尖分生組織的測(cè)定方法

采用三電極系統(tǒng)，以固定好的“三明治”式植物根尖分生組織膜的玻碳電極作為工作電極，以Ag/AgCl電極作為參比電極，以鉑絲電極作為對(duì)電極，以超純水作空白對(duì)照，在一定的電壓下通過(guò)電流—時(shí)間測(cè)定法測(cè)定尿素溶液與植物根尖分生組織作用的響應(yīng)電流值，以響應(yīng)電流的變化率作為檢測(cè)指標(biāo)，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。按公式(1)計(jì)算響應(yīng)電流的變化率ΔI。

式(1)中:I1表示空白對(duì)照的響應(yīng)電流值/A，I2表示待測(cè)定尿素溶液的響應(yīng)電流值/A。